Die Polymerase
Kettenreaktion (PCR) (K.B. Mullis, Nobelpreis Chemie, 1993)
Die
Polymerase-Kettenreaktion wird überall eingesetzt, wenn es darum
geht, genetisches Material spezifisch zu vermehren oder zu verändern.
Es handelt sich dabei um eine enzymatische Reaktion, wobei das
Enzym DNA-Polymerase (hitzestabile Taq DNA-Polymerase aus Thermus
aquaticus) den zum DNA-Einzelstrang komplementären Strang in
Richtung von 5’ nach 3’ mit den entsprechenden
Desoxynukleosidtriphoshaten in Anwesenheit von Mg2+Ionen
synthetisiert. Ausgangspunkt der Synthese sind kurze etwa 20 Basen
lange Oligodesoxynukleotide, welche komplementär zu den 3’
Enden des DNA-Segmentes sind, welches vermehrt (amplifiziert)
werden soll. Das eine Oligodesoxynukleotid wird als der „forward"(sense),
das andere als der „reverse" (antisense) Primer bezeichnet.
Zwischen diesen beiden Primern wird nun die DNA synthetisiert. Je
nach Lage der beiden Primer können verschieden große Fragmente
erhalten werden. Die Primer werden im Überschuß zum
Reaktionsansatz zugegeben. Damit sie aber binden können (annealing),
muß die DNA zuvor denaturiert, d. h. einzelsträngig sein. Dies
geschieht vollständig bei Temperaturen über 90°C. Die
Reaktionsführung ist zyklisch angelegt, eine Wiederholung der
Schritte – Denaturierung – Anlagerung der Primer –
Polymerisation, so daß eine exponentielle Vermehrung der DNA
erfolgt. Da die DNA sich bei jedem Zyklus verdoppelt, erhält man
nach n Zyklen eine 2 exponent n fache Vermehrung. Es werden z. B.
aus Nanogramm-Mengen auf Gelen detektierbare Mengen im
Mikrogrammbereich und mehr erhalten.
Das
folgende Schema wurde von Prof. Kröger, Justus Liebig-Universität,
Gießen entwickelt. 5' bzw. 3' Primer bezeichnet die
Anlagerungsbereiche der Primer zu den jeweils komplementären
Sequenzen. Die einzelnen Schritte wie Denaturierung, Anlagerung
der Primer und Polymerisation werden nicht einzeln dargestellt.
Um die
gebildete DNA zu identifizieren, muss eine Gel-Elektrophorese
durchgeführt werden. DNA wandert bei pH 8 entsprechend ihrer Größe
im elektrischen Feld zum Pluspol, da sie negativ geladen
ist.
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